芝麻(Sesamum indicum L.)是中国重要的特色优质油料作物，具有丰富的营养价值和保健功效(Zhang et al., 2013)。近年来，随着高通量测序技术应用，芝麻生长发育、品质、抗病和抗逆等为主的基因组学研究进展显著(Zhang et al., 2012; 魏利斌等, 2012; Wei et al., 2011)。由于芝麻全基因组测序计划尚未完成(Zhang et al., 2013)，且全长cDNA文库通常包含了生物体表达的全部基因信息，绝大多数克隆中不仅包含有完整的编码框，还包含有5'和3'端的非翻译区。因此，利用全长cDNA文库不仅可以快速发掘大量新基因，还能加快后期的基因结构、蛋白质表达及功能预测等分析进程(Suzuki et al., 1997; Carninci et al., 2000; Zheng et al., 2008; 韩慧霞等, 2010; Wang et al., 2011b)。目前，小麦(Ling et al., 2007; Al-Taweel et al., 2011)、玉米(Jia et al., 2006)、棉花(Wang et al., 2011a)、大豆(Umezawa et al., 2008)、花生(蔡宁波等, 2007)和柑橘(Marques and PerezAmador, 2012)等多种农作物均己成功构建了全长cDNA文库。然而对于芝麻这一重要的特色油料作物，仅构建了种子发育全长cDNA文库(Ke et al., 2011a)，至今尚未见有关构建芝麻生长发育过程不同组织全长cDNA文库的报道。为此，为探明芝麻关键生长发育时期下的基因全长序列信息及表达情况，本文利用Gateway技术对包括芝麻种子在内的根、茎、叶、花和果等组织进行全长cDNA文库构建及其EST序列分析(Hartley et al., 2000)，为芝麻功能基因组学研究提供重要的序列信息资源。

1结果与分析 
1.1文库构建用总RNA及mRNA质量检测
采用1.1%琼脂糖凝胶电泳检测提总RNA质量(图1A)，结果显示28S和18S两个条带均完整清晰，亮度强弱对比适宜；OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.88，OD₂₆₀/OD₂₃₀值为2.07，说明总RNA具有较高的纯度和完整性。对分离纯化后mRNA纯度、浓度进行琼脂糖凝胶电泳检测，显示mRNA纯度、浓度亦较高(图1B)，能满足建库要求。

图1 构建文库用总RNA及mRNA电泳图  注: M: 1 Kb plus DNA ladder marker; A: 总RNA电泳图; B: mRNA电泳图; 1: 总RNA; 2: mRNA Figure 1 Electrophoresis of total RNA and mRNA for cDNA library construction Note: M: 1 Kb plus DNA ladder marker; A: Electrophoresis of total RNA; B: Electrophoresis of mRNA; 1: Total RNA; 2: mRNA

1.2全长cDNA文库大小及质量评价
通过电转化完成该cDNA文库的构建。平板克隆数量统计与计算显示，本次构建的芝麻全长cDNA文库容为5.6×10⁶，文库滴度为1.12×10⁶ cfu/mL，文库质量较高。从中挑取单克隆1.92×10⁵个，保存于500块384孔板中，构建成芝麻生长发育的全长cDNA文库，命名为SiFcDNA文库。

随机挑取32个单克隆进行PCR扩增(图2)。除No.21有两条弱带外，其余31个克隆子的PCR结果均为单带，cDNA文库重组率为96.88%；克隆子插入片段的长度主要集中在1.0~3.0 kb之间，平均插入长度约为1.5 kb。为确定插入片段的全长率，另外从文库中随机挑选25个克隆子进行两端测通。ORF预测及编码蛋白比对显示，除有3条序列无法确定其是否为全长基因外，其余22条序列均具有5'和3'非翻译区，确定为全长cDNA序列，表明SicDNAL文库的全长率为88%。

图2 SiFcDNA文库插入片段大小的检测 注: M: 1 Kb plus DNA ladder marker; 1~32: 随机挑选的32个单克隆插入片段PCR结果 Figure 2 Detection of insert size of SiFcDNA library Note: M: 1 Kb plus DNA ladder marker; 1~32: PCR amplifications of insert fragments in 32 independent clones randomly selected from the library

1.3文库EST序列特征分析
为进一步分析SiFcDNA文库中cDNA序列特征，从500块384孔板中随机选取3块(共计1 152个单克隆)进行5'端单向测序，共计获得高质量EST序列1 088条。经拼接共获得unigene序列867条，其中包含120条contig序列和747条singlets序列；文库冗余度为20.31%。通过与nr、Swiss-Prot等蛋白数据库进行比对分析，在蛋白质或核苷酸水平上具有同源序列的unigene共有821条(94.69%)，其余的46条(5.31%) unigene序列没有匹配到任何同源序列。在具有同源序列的821条unigene中，仅有22条序列能够与芝麻数据库中的已知功能基因相匹配。同时，与当前NCBI公布的来源于芝麻种子发育过程(5~30 d)全长cDNA文库的41 248条EST序列进行本地blastn比对，在本研究获得的unigene序列中，共有196条(22.61%)可以匹配到相应的EST序列，其余671条(77.39%) unigene均未得到匹配EST序列。

随后利用GO数据库对867条unigene序列进行功能注释和比对分析(图3)。共得到774条GO terms注释信息，436 (50.29%)个unigene序列获得了GO功能注释，并分属于GO分类体系的3个亚类26个功能类型中。其中细胞组分(Cellular component)亚类有63个(8.0%)，分子功能(Molecular function)亚类中有436个(56.0%)为，为生物学过程(Biological process)亚类中有275个(36.0%)。此外，在细胞组分类中，细胞(Cell)和细胞部分(Cell part)类型的序列数量比例最高，均为14.2%，。在分子功能类型中，催化活性(Catalytic activity)和蛋白结合(Binding)类型的序列比例最高，分别为47.2%和45.2%。在生物学过程功能类型中，代谢过程(Metabolic process)和细胞过程(Cellular process)功能类型所占比例最高，分别为55.0%和29.6%。

图3 SiFcDNA文库unigene的GO功能分类 注: C1: 细胞; C2: 细胞部分; C3: 胞膜; C4: 大分子复合物; C5: 细胞器; C6: 细胞器部分; M1: 抗氧化活性; M2: 蛋白结合; M3: 催化活性; M4: 酶调节器; M5: 分子传感; M6: 营养库; M7: 结构分子; M8: 转录调节; M9: 翻译调节; M10: 转运蛋白; B1: 解剖学结构形成; B2: 生物调节; B3: 细胞组分生物形成; B4: 细胞组分组织; B5: 细胞过程; B6: 定位建成; B7: 定位; B8: 代谢过程; B9: 色素形成; B10: 刺激反应 Figure 3 Gene ontology (GO) classification of the unigenes in SiFcDNA library Note: C1: Cell; C2: Cell part; C3: Envelope; C4: Macromolecular complex; C5: Organelle; C6: Organelle part; M1: Antioxidant; M2: Binding; M3: Catalytic; M4: Enzyme regulator; M5: Molecular transducer; M6: Nutrient reservoir; M7: Structural molecule; M8: Transcription regulator; M9: Translation regulator; M10: Transporter; B1: Anatomical structure formation; B2: Biological regulation; B3: Cellular component biogenesis; B4: Cellular component organization; B5: Cellular process; B6: Establishment of localization; B7: Localization; B8: Metabolic process; B9: Pigmentation; B10: Response to stimulus

1.4 EST-SSR分布特征
利用在线SSRIT分析软件对拼接的867条unigene序列进行EST-SSR特征分析，共查找符合标准的EST-SSR 173个(19.95%) (表1)，分布于160条unigene序列中。867条非冗余unigene序列拼接总长度为827.7 kb，平均每4.78 kb出现一个SSR。在2~6碱基五种重复基元的SSR中，以三核苷酸为重复基元的SSR出现次数最多，为88次，占所有SSR总数的50.87%；其次是二核苷酸(27.75%)，四核苷酸(14.45%)，六核苷酸(4.05%)和五核苷酸(2.89%) (表1)。此外，在以二核苷酸和三核酸为重复基元的SSR中，以AG/CT和AAG/CTT为重复基元的SSR出现次数最多，分别占各自基元类型的68.75%和13.64%，占SSR总数的19.08%和6.94% (图4)。

表1 867条unigene 序列中的SSR重复基元类型及分布频率 Table 1 SSR repeat motifs types and their distribution frequencies in 867 unigene sequences

图4 SiFcDNA文库中unigene序列的SSRs分布频率 注: 仅列出基元个数大于5的SSR类型; a: 其他类型 Figure 4 The distribution frequency of SSRs in unigenes in SiFcDNA library Note: Only the SSR types with the number of motif units greater than 5 were listed in this figure; a: Other motifs

2讨论
本文所构建的芝麻全长cDNA文库SiFcDNA采用Gateway技术构建完成(Hartley et al., 2000)。该技术是一种基于λ嗜菌体位点特异的重组系统，广泛应用于多种作物的cDNA文库构建(Hartley et al., 2000; Ohara and Temple, 2001; 梅文倩等, 2004; 胡金艳等, 2007; 郭姗姗等, 2011; 李晨等, 2010)。因该技术不涉及文库扩增、载体连接以及限制性内切酶和连接酶参与，从而有效避免传统cDNA文库构建过程中cDNA易被切断、步骤繁琐以及小片段克隆易富集而大片段克隆丰度易低等问题(毛新国等, 2006; 董志敏等, 2006; 朱利军等, 2009)，有利于进行高效的大规模EST测序和基因克隆鉴定。在文库构建中，为满足低丰度mRNA筛查的要求，并使获取所需克隆的概率达到99%以上，一般要求cDNA文库滴度不少于1.0×10⁶ pfu/mL (Clarke and Carbon, 1976; Sambrook and Russell, 2005)。本文构建的cDNA文库滴度为1.12×10⁶ pfu/mL，重组率为96.88%，平均插入长度约为1.5 kb，全长率为88.0%，表明文库质量较高，能够完全满足文库构建及下游实验的要求。

对所获得的unigene序列进行比对分析，结果发现有46条(5.31%) unigene序列没有在NCBI数据库中匹配到任何同源序列，推测认为该部分序列可能为芝麻物种特有的基因序列。为分析本文库已测序列与NCBI数据库中已公布的芝麻序列的关系，我们将867条unigene序列与Ke等(2011b)构建的芝麻种子全长cDNA文库数据库进行blastn比对，仅有22.61%的unigene序列可以与其有效匹配。说明本文构建的SiFcDNA文库中不仅包含有在芝麻种子组织中表达的基因，还含有大量在Ke等(2011b)所构建的芝麻种子全长cDNA文库中未检测到的在其他组织中表达的基因。此外，受芝麻基因组序列信息匮乏以及芝麻功能基因鉴定与研究工作相对滞后的限制，在SiFcDNA文库中，绝大部分unigene (97.46%)无法匹配到相应的芝麻功能基因序列，由此也说明开展芝麻全长cDNA文库构建研究对加快芝麻功能基因组学研究具有重要意义。

在867个unigene中，SSR分布频率为4.78 kb，该结果与Ke等(2011b)报道的8.9 kb SSR以及Wei等(2011)和Zhang等(2012)利用芝麻转录组序列发掘SSR的研究结果差异较大。类似结果也广泛出现在其他作物的EST-SSR发掘过程中。Cardle等(2000)对水稻、玉米和大豆中的EST进行SSR查找，发现上述作物中SSR分布频率分别为3.4 kb、8.1 kb和7.4 kb；Gao等(2003)则发现水稻、玉米和大豆的EST中分别为11.81 kb、28.32 kb和23.80 kb。这可能与SSR搜索标准、测序数据来源以及数据库大小不同有关(Varshney et al., 2005; Wei et al., 2008)。在SSR重复基元的特征分析方面，本研究与Ke等(2011b)的研究结果类似：在2~6碱基五种重复基元类型中，均发现以三核苷酸为重复基元的SSR出现频率最大(占SSR总数的一半以上)；在二、三核酸重复基元类型中，以AG/CT和AAG/CTT为重复基元的SSR出现频率为最大。

本研究采用Gateway技术构建了高质量的芝麻生长发育全长cDNA文库(SiFcDNA)，文库容为5.6×10⁶；评估了867条unigene序列的功能类型及EST-SSR分布特征。为高效筛选和克隆芝麻全长功能基因奠定了基础，并将推动芝麻功能性SSR标记开发、高密度遗传图谱构建以及芝麻种质资源遗传多样性分析等基础研究。

3材料与方法
3.1试验材料
本研究以中国主栽芝麻品种豫芝11号为材料。种子由河南农业科学院芝麻研究中心保存。2011年挑选健康饱满种子播种于河南省农业科学院原阳试验基地，普通种植管理。盛花期选取长势良好单株，分别对根、茎、叶以及处于不同发育时期的花蕾和蒴果取样，液氮速冻后，置于-70℃保存。

电转感受态细胞DH10B购置于Invitrogen公司。TRIzol试剂、FastTrack 2.0 mRNA分离试剂盒、Superscript全长文库构建试剂盒Ⅱ以及1 Kb Plus DNA Ladder Marker等试剂均购自Invitrogen公司。

3.2总RNA提取及mRNA分离
液氮下对样品进行充分研磨，提取总RNA，操作步骤参照TRIzol Reagent (Invitrogen)使用说明。采用1.1%琼脂糖凝胶电泳以及OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀检测结果评价总RNA的完整性及其纯度；参照FastTrack 2.0 Kit使用说明分离纯化样品mRNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测mRNA质量。

3.3全长cDNA文库构建
参照Superscript全长文库构建试剂盒ò使用说明构建全长cDNA文库：以mRNA为模板，利用带有生物素和attB2序列的polyT引物进行cDNA第一链的合成；分离获得单链全长cDNA，并在第一链全长cDNA 5'末端加入attB1接头；在高保真DNA聚合酶的作用下，合成全长cDNA第二链。将两侧带有attB序列的全长cDNA与pDONR222载体进行Gateway BP重组反应，将重组产物电转化DH10B感受态细胞。

3.4 cDNA文库滴度和库容测定
取转化后的细菌原液10 μL稀释1 000倍后，从中取出50 μL涂布LB平板(含相应抗性)，第二天计数。文库滴度=平板上的克隆数/50 μL×1 000×1 000 cfu/mL；总克隆数CFU=文库滴度×总mL数。

3.5文库重组率、插入片段大小及全长率鉴定
从LB平板随机挑取32个克隆子，利用M13F/R引物进行菌落PCR，电泳检测重组克隆子比例(即重组率)及平均插入片段大小。此外，从LB平板中随机挑取25个克隆子，提取重组质粒并完成序列测通。利用GenomeScan、ORFFinder和Blast对25个克隆子插入序列分别进行ORF预测，核苷酸和蛋白质数据库比对，分析全长cDNA序列数量和比例。

3.6文库5'端测序及序列分析 
从装有单克隆的500块384孔板中，随机选取3块384孔板(共1 152个单克隆)，进行5'端单向测序。去除序列两端的载体序列及污染序列后，利用Cap3序列拼接软件进行EST序列拼接，拼接参数为每两条进行拼接的序列至少有50 bp重叠匹配序列，且重叠区序列相似性为95%以上。随后将获得的unigene序列(包括拼接而成的contig序列及单拷贝singlets序列)分别与nr和Swiss-Prot数据库进行blastx分析，获取最佳注释(E-value<1e-05) (魏利斌等, 2012)；采用Blast2GO (version 2.3.5)软件进行序列GO注释信息分析；利用WEGO (Web Gene Ontology Annotation Plot) Web工具完成unigene序列的GO功能注释和GO功能分类统计(魏利斌等, 2012)。利用在线SSRIT software (http://www.gramene.org/db/ markers/ssrtool/)查找含有2~6个碱基SSR重复基元的unigene序列。SSR查找标准为重复次数≥3次，重复序列总长度≥12 bp。

作者贡献
张海洋和苗红梅是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并指导论文修改；魏利斌完成序列数据分析及论文初稿的写作；张体德、李春和琚铭参与实验设计和试验结果分析；张海洋是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家重点基础研究发展计划973项目(2011CB109304)和现代农业产业技术体系建设专项(CARS-15)共同资助。

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